萊斯大學(xué)的研究人員開發(fā)了一種計(jì)算模型來(lái)量化CRISPR-Cas9蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)其基因組編輯目標(biāo)的機(jī)制。

化學(xué)和化學(xué)和生物分子工程的Rice教授和校友Alexey Shvets的Anatoly Kolomeisky改編了他們之前開發(fā)的系統(tǒng)，以顯示蛋白質(zhì)通常如何找到它們的生物靶標(biāo)。他們希望修改后的模型將有助于揭開CRISPR的其余奧秘。

在其天然狀態(tài)下，CRISPR代表“聚集有規(guī)律的間隔短回文重復(fù)”，是細(xì)菌保護(hù)自身免受病毒感染的生物學(xué)機(jī)制。這些細(xì)菌包含了一份外國(guó)DNA，并建立了所有入侵者的記錄。它們?cè)跈z測(cè)到新入侵者時(shí)引用該記錄并使用它來(lái)銷毀它們。

近年來(lái)，研究人員已開始調(diào)整基因組編輯中使用的機(jī)制，該機(jī)制具有治愈疾病和增強(qiáng)包括人類在內(nèi)的生物體的潛力。但是，使用CRISPR方法的系統(tǒng)之一CRISPR-Cas9蛋白將切割并替換錯(cuò)誤的靶序列，引入突變，這是一個(gè)絆腳石。

生物物理雜志中描述的Rice模型發(fā)現(xiàn)，當(dāng)允許這些脫靶編輯發(fā)生時(shí)，CRISPR-Cas9可能更有效地定位良好的靶標(biāo)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)不會(huì)浪費(fèi)時(shí)間與脫靶相關(guān)以繼續(xù)搜索。

Kolomeisky說(shuō)，這可能是也可能不是一件好事，但它肯定值得研究。

“錯(cuò)誤率(脫靶率)有時(shí)是10-20%，”他說(shuō)。“我們有兩個(gè)想法：一個(gè)是病毒變異非?？欤苍S細(xì)菌試圖削減只是稍微突變的目標(biāo)，以便更靈活。另一個(gè)是有蛋白質(zhì)可以糾正錯(cuò)誤，所以如果錯(cuò)誤的削減并不多，系統(tǒng)可以容忍它們。

“我們模型的結(jié)果是，我們認(rèn)為脫靶切割真的可以幫助目標(biāo)切割更快。”

Kolomeisky說(shuō)，他的模型是一個(gè)簡(jiǎn)單的步驟，可以找出CRISPR編輯的動(dòng)態(tài)。“CRISPR-Cas9是最受歡迎的變種，因?yàn)樗缓幸环N蛋白質(zhì)，在生物學(xué)上更容易使用，”他說(shuō)。

萊斯實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了其原始模型，以了解蛋白質(zhì)如何沿著DNA滑動(dòng)以找到目標(biāo)并觸發(fā)基因轉(zhuǎn)錄等過程。Kolomeisky指出，CRISPR先驅(qū)Jennifer Doudna發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9不會(huì)以同樣的方式尋找。“她發(fā)現(xiàn)DNA不會(huì)在任何地方滑動(dòng)，”他說(shuō)。

相反，根據(jù)Doudna和她的團(tuán)隊(duì)，蛋白質(zhì)最初識(shí)別三核苷酸PAM(用于原型間隔相鄰基序)序列，標(biāo)記潛在靶標(biāo)的位置。“CRISPR發(fā)現(xiàn)并結(jié)合PAM，然后其相關(guān)的RNA探索相鄰的DNA，看看它是否是目標(biāo)，”Kolomeisky說(shuō)。“如果是的話，蛋白質(zhì)會(huì)開始減少。如果沒有，它會(huì)解除分離，并尋找其他地方。”

在Doudna隨后移除PAM序列的實(shí)驗(yàn)中，CRISPR-Cas9蛋白根本找不到它們的靶標(biāo)。因此，PAMs具有重要作用，而不僅僅是一個(gè)通用的間隔物，他說(shuō)。“一旦我讀到這篇文章，我就知道我們也可以在這里使用我們的模型。”

理論模型著眼于第一次通過過程 - 當(dāng)系統(tǒng)超過物理或化學(xué)閾值時(shí)發(fā)生的過程，如找到相關(guān)的PAM - 跟蹤插入到細(xì)胞中的CRISPR-Cas9蛋白，因?yàn)樗鼈兪紫日{(diào)查PAM序列，然后，在與PAM結(jié)合時(shí)，尋找與Cas9 RNA相匹配的DNA靶標(biāo)。

他們發(fā)現(xiàn)，通過與“錯(cuò)誤”DNA分離而避免脫靶的切割的CRISPRs比需要切斷目標(biāo)的DNA需要更長(zhǎng)時(shí)間才能解決。“走向錯(cuò)誤的PAM需要時(shí)間，”Kolomeisky說(shuō)。“我們的計(jì)算結(jié)果表明，當(dāng)有時(shí)會(huì)在錯(cuò)誤的地方切割時(shí)，CRISPR可以更快找到真正的目標(biāo)。進(jìn)入正確目標(biāo)的部分可能會(huì)更小，但最終會(huì)削減它們。

“這是一個(gè)簡(jiǎn)單的模型，完全可以解決，”Kolomeisky說(shuō)。“如果有人想測(cè)試，該模型可以提供具體的預(yù)測(cè)，并在某些情況下提供應(yīng)該觀察的趨勢(shì)。” 模型中遺漏的是能夠查看RNA密鑰是否同時(shí)識(shí)別其目標(biāo) - 同時(shí)與DNA結(jié)合 - 或依次與核苷酸核苷酸結(jié)合。

“關(guān)于CRISPR的最令人印象深刻的事情不是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)，而是在生物技術(shù)領(lǐng)域創(chuàng)造了一場(chǎng)革命，因?yàn)樗馕吨谌魏渭?xì)胞中我們都能在特定位置切割任何DNA，非常精確，”科洛梅斯基說(shuō)。“我希望我們的工作能夠激發(fā)更多的基礎(chǔ)研究，因?yàn)槲曳浅Ｏ矚gCRISPR方法。但是當(dāng)人們應(yīng)用它而不理解它在分子水平上如何工作時(shí)，我感到不快樂。”