利用X射線揭示蛋白質(zhì)的原子級(jí)三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)在理解這些分子如何在細(xì)菌，病毒，植物和人類中發(fā)揮作用方面取得了無(wú)數(shù)進(jìn)展 - 并指導(dǎo)了精確藥物的開發(fā)以對(duì)抗疾病等作為癌癥和艾滋病。但是許多蛋白質(zhì)不能生長(zhǎng)成足夠大的晶體，因?yàn)樗鼈兊脑优帕袝?huì)被破譯。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，美國(guó)能源部(DOE)布魯克海文國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家和哥倫比亞大學(xué)的同事已經(jīng)開發(fā)出一種從微小晶體中解決蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的新方法。

該方法依賴于獨(dú)特的樣品處??理，信號(hào)提取和數(shù)據(jù)組裝方法，以及能夠在Brookhaven的國(guó)家同步加速器光源II(NSLS-II)上聚焦強(qiáng)X射線的光束線 - 美國(guó)能源部科學(xué)辦公室用戶設(shè)施 - 到百萬(wàn)分之一米的位置，大約是人類頭發(fā)寬度的五十分之一。.

“我們的技術(shù)確實(shí)打開了處理以前難以接近的微晶的大門，包括難以結(jié)晶的細(xì)胞表面受體和其他膜蛋白，柔性蛋白質(zhì)和許多復(fù)雜的人類蛋白質(zhì)，”布魯克海文實(shí)驗(yàn)室科學(xué)家劉群說(shuō)。該研究的相應(yīng)作者于2019年5月3日在IUCrJ(國(guó)際晶體學(xué)聯(lián)合會(huì)期刊)上發(fā)表。

解讀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

自1958年以來(lái)，蛋白質(zhì)晶體學(xué)一直是解決蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要方法，隨著時(shí)間的推移，隨著X射線源變得越來(lái)越強(qiáng)大，可以進(jìn)行更精確的結(jié)構(gòu)測(cè)定。為了確定一種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，科學(xué)家們測(cè)量了像NSLS-II產(chǎn)生的那些x射線如何衍射或反彈，由同一蛋白質(zhì)分子的許多拷貝組成的有序晶格中的原子以相同的方式排列。衍射圖案?jìng)鬟_(dá)有關(guān)原子位于何處的信息。但這還不夠。

“只有衍射的X射線波的振幅才會(huì)記錄在探測(cè)器上，而不是它們的相位(波浪之間的時(shí)間)，”劉說(shuō)。“兩者都需要重建三維結(jié)構(gòu)。這就是所謂的結(jié)晶相問題。”

晶體學(xué)家通過(guò)從不同類型的散射中收集相位數(shù)據(jù)來(lái)解決這個(gè)問題，稱為反常散射。當(dāng)比蛋白質(zhì)的主要成分碳，氫和氮重的原子吸收并重新發(fā)射一些X射線時(shí)，就會(huì)發(fā)生異常散射。當(dāng)X射線能量接近那些重原子喜歡吸收的能量時(shí)，就會(huì)發(fā)生這種情況?？茖W(xué)家為了這個(gè)目的，有時(shí)人為地將重原子如硒或鉑插入蛋白質(zhì)中。但是在整個(gè)蛋白質(zhì)分子中天然存在的硫原子也可以產(chǎn)生這樣的信號(hào)，盡管它們較弱。盡管這些異常信號(hào)很弱，但是大晶體通常具有足夠的硫原子拷貝，使其具有足夠的硫原子以使其可測(cè)量。

“一旦你知道了硫的位置，就可以計(jì)算出其他蛋白質(zhì)原子的相位，因?yàn)榱蚝推渌又g的關(guān)系是固定的，”劉說(shuō)。

但根據(jù)定義，微小的晶體沒有那么多感興趣的蛋白質(zhì)拷貝。因此，Brookhaven / Columbia團(tuán)隊(duì)不是從單個(gè)大晶體中的蛋白質(zhì)重復(fù)拷貝中尋找衍射和相位信息，而是開發(fā)出一種從許多微小晶體中進(jìn)行測(cè)量的方法，然后匯總集體數(shù)據(jù)。

微小的水晶，效果很好

為了處理微小的晶體，該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了帶有微型孔的樣品網(wǎng)格。在將含有微晶的溶劑倒在這些安裝好的網(wǎng)格上之后，科學(xué)家們除去了溶劑并凍結(jié)了被困在網(wǎng)格上的晶體。

“盡管如此，我們?nèi)匀幻媾R挑戰(zhàn)，因?yàn)槲覀儫o(wú)法看到微小晶體在我們的網(wǎng)格上的位置，”劉說(shuō)。“為了找到答案，我們?cè)贜SLS-II的Frontier Microfocusing Macromolecular Crystallography(FMX)光束線上使用微衍射來(lái)測(cè)量整個(gè)網(wǎng)格。逐行掃描，我們可以找到隱藏這些晶體的位置。”

正如FMX的主要光束線科學(xué)家Martin Fuchs所解釋的那樣，“FMX光束線可以將X射線束的全部強(qiáng)度聚焦到1微米或百萬(wàn)分之一米的大小。我們可以精確控制光束尺寸到將它與晶體的大小相匹配 - 在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)的情況下為5微米。這些能力對(duì)于獲得最佳信號(hào)至關(guān)重要，“他說(shuō)。

另一位FMX光束線科學(xué)家Wuxian Shi指出，“電網(wǎng)測(cè)量中收集的數(shù)據(jù)包含有關(guān)晶體位置的信息。此外，我們還可以看到每個(gè)晶體的衍射情況，這使我們只能選擇最好的晶體數(shù)據(jù)采集。”

然后，科學(xué)家們能夠操縱樣品架，將每個(gè)映射出的感興趣的微晶放回精密X射線束的中心進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。

他們使用光束線上可用的最低能量 - 調(diào)整為盡可能接近硫原子的吸收能量 - 并收集異常散射數(shù)據(jù)。

“大多數(shù)晶體束線無(wú)法達(dá)到優(yōu)化異常信號(hào)的硫吸收邊緣，”哥倫比亞大學(xué)的共同作者Wayne Hendrickson說(shuō)。“幸運(yùn)的是，NSLS-II是世界領(lǐng)先的同步加速器光源，提供明亮的X射線，覆蓋廣泛的X射線能量。即使我們的能量水平略高于硫的理想吸收能量，它也會(huì)產(chǎn)生異常信號(hào)我們需要。”

但科學(xué)家們?nèi)匀恍枰鲂┕ぷ鱽?lái)提取這些重要的信號(hào)，并從許多微小的晶體中收集數(shù)據(jù)。

“我們實(shí)際上獲得了數(shù)千條數(shù)據(jù)，”劉說(shuō)。“我們使用了大約1400個(gè)微晶，每個(gè)微晶都有自己的數(shù)據(jù)集。我們必須將這些微晶的所有數(shù)據(jù)放在一起。”

他們還必須清除受強(qiáng)烈X射線損壞或原子排列略有變化的晶體數(shù)據(jù)。

NSLS-II的結(jié)構(gòu)生物學(xué)項(xiàng)目副光子部門主管兼項(xiàng)目經(jīng)理Sean McSweeney表示，“單個(gè)微晶在被X射線損壞之前不能充分地衍射X射線以獲得結(jié)構(gòu)解決方案。”“對(duì)于只有幾微米的晶體，特別是細(xì)菌細(xì)胞的大小，尤其如此。我們需要一種方法來(lái)解釋這種損傷和晶體結(jié)構(gòu)的變化，因此不會(huì)影響我們的結(jié)果。”

他們通過(guò)復(fù)雜的多步驟工作流程完成了這些目標(biāo)，該過(guò)程篩選了數(shù)據(jù)，可能由輻射損壞或不相容的晶體引起的丟棄的異常值，并最終提取異常散射信號(hào)。

“這是關(guān)鍵的一步，”劉說(shuō)。“我們開發(fā)了一種計(jì)算程序，以確保只有兼容的數(shù)據(jù)以一種方式合并，以使各個(gè)微晶與衍射圖案對(duì)齊。這為我們提供了結(jié)構(gòu)測(cè)定所需的信噪比。”

應(yīng)用該技術(shù)

該技術(shù)可用于確定已經(jīng)證明難以結(jié)晶成大尺寸的任何蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。這些包括細(xì)胞表面受體，允許動(dòng)物和植物等高級(jí)生命形態(tài)的細(xì)胞通過(guò)釋放激素，傳遞神經(jīng)信號(hào)或分泌與細(xì)胞生長(zhǎng)和免疫相關(guān)的化合物來(lái)感知和響應(yīng)周圍的環(huán)境。

“為了通過(guò)進(jìn)化適應(yīng)環(huán)境，這些蛋白質(zhì)具有延展性，并且具有許多不均勻的修飾，”劉說(shuō)。“很難在水晶中獲得大量的重復(fù)副本，因?yàn)樗鼈儾荒芎芎玫匕b。”

在人類中，受體是藥物的共同目標(biāo)，因此了解其各種結(jié)構(gòu)可以幫助指導(dǎo)新的，更有針對(duì)性的藥物的開發(fā)。

但該技術(shù)并不僅限于小晶體。

“我們開發(fā)的方法可以處理小蛋白質(zhì)晶體，但它也可以用于任何大小的蛋白質(zhì)晶體，任何時(shí)候你需要結(jié)合多個(gè)樣品的數(shù)據(jù)，”劉說(shuō)。